“Oxidacion Enzimatica” Quimica y Bioquimica Agroindustrial

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INTRODUCCION

Cuando cortamos algunas frutas y exponemos su carne a la acción del aire, vemos que en unos instantes se oscurece. Esto ocurre con frutas como la manzana, la pera, el plátano y con otros alimentos como las papas o los champiñones entre otros.

El pardeamiento, oxidación u oscurecimiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como substrato el oxígeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prácticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. 

En el hombre es la responsable de la formación de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalópodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrópodos participa en el endurecimiento de las cutículas del caparazón, al formar quinonas que reaccionan con las proteínas, insolubilizándolas. En los vegetales no se conoce con precisión cuál es su papel fisiológico. 

El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato.
También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubrió primero en los champiñones, en los que el efecto de pardeamiento tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente. 

OXIDACIÓN ENZIMATICA

I.- ENZIMAS
Las enzimas son proteínas altamente especializadas que tienen como función la catálisis o regulación de la velocidad de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos.

Casi todas las reacciones químicas de las células son catalizadas por enzimas, con la particularidad de que cada enzima solo cataliza una reacción, por lo que existirían tantas  enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no biológicos son inespecíficos.

En una reacción catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S), es decir la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato es modificado químicamente y se convierte en uno o más productos (P). Como esta reacción es reversible  se expresa de la siguiente manera:

II.- OXIDACION ENZIMATICA

Es el resultado de la acción del oxígeno contenido en el aire en combinación con los compuestos químicos de la fruta o verdura, en concreto sobre los fenoles.

En la reacción interviene como catalizador una enzima, la polifenol oxidasa (PFO), por la cual los fenoles se combinan con el oxígeno para transformarse en quinonas, que se polimerizan o reaccionan con grupos amino de diferentes compuestos formando compuestos coloridos que reciben el nombre de melaninas y que tienen propiedades antimicrobianas, y que podrían ser un mecanismo de defensa de los vegetales contra infecciones.

Es catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar  prácticamente en todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la formación de pigmentos del pelo y de la piel. 

En los cefalópodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrópodos participa en el endurecimiento de las cutículas del caparazón, al formar quinonas que reaccionan con las proteínas, insolubilizándolas. En los vegetales no se conoce con precisión cuál es su papel fisiológico. 

El enzima responsable de la oxidación enzimática recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal sustrato. 
También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubrió primero en los champiñones, en los que el efecto de oxidacion tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente.

Champiñones cortados, mantenidos a temperatura ambiente y fotografiados a distintos tiempos.

En el campo de los alimentos, la oxidación enzimática puede ser un problema muy serio en 
frutas, champiñones, patatas y otros vegetales, y también en algunos crustáceos, e incluso en la industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o incluso los hacen inaceptables para el consumidor. 

Estas pérdidas son muy importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos trascendentales para la economía de muchos países poco desarrollados. 

A pesar del nombre genérico de “oxidación”, los colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. 

En algún caso, como en las pasas, otras frutas secas, el cacao, la oxidación enzimática contribuye al desarrollo de los colores característicos de estos productos, aunque como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave. 

Además de la alteración del color, los productos formados pueden reaccionar con las proteínas, insolubilizándolas. 

Por otra parte, puede producirse también una pérdida nutricional, ya que aunque la polifenoloxidasa no oxida directamente al ácido ascórbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la reacción. 

Estructura de las polifenoloxidasas

Las polifenoloxidasas (PPOs) son enzimas (encontradas principalmente en plantas y hongos) que catalizan una reacción que transforma o-difenoles en o-quinonas. 

Las o-quinonas son muy reactivas y atacan a una gran variedad de componentes celulares, favoreciendo la formación de polímeros negro-marrón. 

Las polifenoloxidasas son también en muchos casos capaces de oxidar aminas aromáticas para formar o-aminofenoles.

Éstos polímeros son los responsables del oscurecimiento de tejidos vegetales cuando se dañan físicamente. Ésto se observa fácilmente en plátanos o papas, que tienen altos niveles de PPOs. 
Cuando la célula se encuentra sana e intacta, las PPOs y sus sustratos, los fenoles, se encuentran en compartimientos separados (cloroplastos y vacuolas, respectivamente). Sin embargo, cuando la célula se desorganiza al envejecer, o como resultado de daño físico o infeccioso, las enzimas y sustratos se juntan y sucede la reacción descrita. 

El oscurecimiento producido por éstas enzimas causa grandes pérdidas a la industria agropecuaria. Por ésto, el contenido de polifenol oxidasas, y su nivel de actividad son muy importantes para determinar la calidad de frutos y vegetales.

La polifenoloxidasa, tiene dos actividades enzimáticas, una hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando difenoles a quinonas (“catecolasa”). Dependiendo de la fuente, la actividad “cresolasa” es mayor o menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las enzimas tienen actividad “catecolasa”. 

La característica estructural más importante de estas enzimas es la presencia en su centro activo de dos átomos de cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo largo de la evolución en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias al hombre. En su entorno se sitúan una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos, que también son importantes en su actividad, para la unión de los sustratos.

La forma de actuación del enzima, con dos actividades distintas, ha sido un misterio, aclarado en parte hace relativamente pocos años.

 El enzima cataliza dos reacciones porque en el estado nativo se encuentra en dos formas distintas, la llamada met-tirosinasa, que es activa solamente sobre monofenoles, y la oxi-tirosinasa. 


Estas formas se interconvierten entre ellas, de forma acoplada al desarrollo de la reacciones que catalizan. En los crustáceos (y en los insectos), la polifenoloxidasa se encuentra en forma de proenzima, inactiva, que es activada por proteolisis por una proteasa endógena. Diversas sustancias producidas por microrganismos activan la proteolisis del proenzima y la formación de enzima activo. 

La reacción de la oxidación enzimática 

La oxidación enzimatica es un conjunto complejo de reacciones, que se inicia por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática. La primera de ellas, cuando el sustrato presente es un monofenol, es su transformación en difenol. 

La segunda, la transformación del difenol en quinona. En el caso de la tirosina (monofenol) se forma primeramente la dopa (difenol) y luego la dopaquinona (quinona). 

 A partir de la formación de la quinona, la reacción progresa de forma espontánea. Las quinonas se pueden convertir en trifenoles por reacción con el agua, y posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy reactivas, dando lugar a polímeros y reaccionando con otras sustancias presentes en el alimento, especialmente proteínas. 
Los productos finales, llamados melaninas, son de color muy oscuro, o negro, e insolubles en agua. Estos polímeros tienen propiedades antimicrobianas, y podrían ser un mecanismo de defensa de los vegetales contra infecciones.

Sustratos

Los sustratos de la reacción pueden ser monofenoles o difenoles. La tirosina es el sustrato principal de la polifenoloxidasa en los crustáceos, y también se encuentra presente en vegetales como la lechuga o en los champiñones.

En los vegetales, el sustrato más extendido es probablemente el ácido clorogénico, en el que el grupo fenólico se encuentra unido a un resto de azúcar, que se encuentra, entre otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, aguacates y patatas. En algunos vegetales se encuentran además DOPA, dopamina, p-cresol, ácido cafeico y otros fenoles. 

Control de la reacción de la oxidación

El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima se encuentra en los plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y también en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenólicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. 

Cuando se rompe la compartimentalización por un daño mecánico, como el triturado, corte o congelación y descongelación, la reacción de oxidación se puede producir. También se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción. 


Además de manteniendo la compartimentalización, la reacción de oxidación se puede frenar actuando sobre diferentes factores: 
  • Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte
  • Bajando al temperatura
  • Reduciendo el pH
  • Desnaturalizando el enzima

Generalmente estos factores actúan de forma combinada. Así, el descenso de pH puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima, (su pH óptimo está entre 5 y 7), pero también, si es suficientemente bajo, desnaturalizándola de forma irreversible. 

Los reductores pueden actuar de varias formas, entre ellas revertiendo la reacción de quinonas a fenoles. También pueden actuar directamente sobre el centro activo del enzima, transformando el cobre 2 en cobre 1, que se disocia más fácilmente. 

El sulfito y la cisteína, además de reaccionar con las quinonas reduciéndolas a difenoles, inactivan el enzima.
Los sulfitos presentan el problema de su toxicidad diferenciada para algunas personas, un pequeño porcentaje de los asmáticos, que pueden sufrir crisis severas con cantidades incluso inferiores a los límites legales. 

Un inhibidor muy eficiente la  actividad de la polifenoloxidasa de los crustáceos es el ácido bórico, aunque actualmente está prohibido su uso, dados los riesgos de toxicidad. 

El ácido ascórbico, es un inhibidor de la reacción muy eficaz en principio, al reconvertir las quinonas en fenoles, pero la inhibición es solamente temporal, al agotarse el ácido ascórbico con el transcurso de la reacción. Además, posteriormente puede ocasionar problemas, ya que el dehidroascórbico formado puede dar lugar a una reacción de oxidación específica.
 Dependiendo de las condicioes de uso, el ácido ascórbico puede también destruir el enzima al modificar las histidinas del centro activo por reacciones mediadas por radicales libres. 

Los agentes quelantes, capaces de eliminar los átomos de cobre del centro activo del enzima, y consecuentemente inactivarla, son inhibidores muy eficientes. 
Pueden utilizarse el EDTA, pirofosfato, y especialmente el ácido cítrico, que combina el efecto de la acidez con la capacidad secuestrante de metales. 

Algunas otras sustancias, como el ácido benzoico y otros compuestos aromáticos, actúan reduciendo la actividad del enzima al competir con los sustratos. Y, por supuesto, la desnaturalización térmica, por ejemplo mediante escaldado con vapor, es un sistema muy eficaz, cuando puede utilizarse. 


Actualmente se ensayan combinaciones de tecnologías o barreras capaces de controlar el pardeamiento enzimático sin modificar otras propiedades sensoriales y nutricionales. Algunas de las tecnologías ensayadas son:

  • Métodos Físicos de Control de Pardeamiento Enzimático: Tratamientos térmicos suaves,Refrigeración, Eliminación de Oxígeno, Recubrimientos Comestibles, Envasado enAtmósferas Modificadas, Tratamientos con Tecnologías Emergentes No-térmicas (AltaPresión, Pulsos Eléctricos, etc.).


Métodos Químicos de Control del Pardeamiento Enzimático: Agentes Reductores (ácido ascórbico), Agentes quelantes (EDTA), Agentes Complejantes (ciclodextrinas), Inhibidores enzimáticos (4-hexilresorcinol), Disminución del pH (adición de ácidos orgánicos). 

Prevención de la oxidación

Algunos factores influyen en la reacción y pueden ser usados para prevenir la oxidación de frutas en por ejemplo ensaladas. 
  • Los ácidos retardan o detienen. Las frutas ácidas, con un pH bajo 5, como naranjas y limones, por tanto no se pardearan. Por consiguiente el jugo de limón, vinagre u otros ácidos, previenen la oxidación cuando son esparcidos sobre frutas frescas cortadas. Solo las frutas no ácidas con un pH entre 5 y 7 son sensitivas a la oxidación. 
  • La reacción necesita oxígeno. Remover el oxígeno a través de envasar las frutas frescas bajo atmósfera libre de oxígeno, o añadir vitamina C como un antioxidante, previene o retarda la oxidación. 
  • La enzima es sensible al calor. Esto significa que escaldar o calentar las frutas también previene la oxidación. Sin embargo, el calentamiento como tal puede causar otros cambios en el aroma y textura de la fruta. 
  • El enfriamiento retarda la reacción enzimática. Las frutas frescas cortadas almacenadas en el refrigerador pardearán más lentamente que las que se encuentran a temperatura ambiente. Sin embargo, cuando son sacadas del refrigerador la reacción continuará. 

Por otro lado, la presencia de hierro o cobre puede incrementar el porcentaje de la reacción. Esto puede ser fácilmente observado cuando la fruta es cortada con un cuchillo corroído o mezclada en un tazón de cobre. 

Otras enzimas relacionadas 

Las lacasas son capaces de oxidar difenoles con los grupos OH en posición para. Estas enzimas tienen un centro activo semejante al de la polifenoloxidasa, también con iones de cobre unidos a histidina, pero el mecanismo de actuación es distinto. 

En la reacción se generan radicales libres, que pueden inducir otras reacciones de oxidación. Son glicoproteínas con un contenido importante de glúcidos, y generalmente son muy poco específicas en cuanto a substrato. 

Se encuentran en algunos vegetales superiores, pero sobre todo en algunos hongos fitopatógenos. Pueden representar un problema en el caso de contaminación de las uvas. 

III.- CONCLUSIONES

La oxidación enzimática puede ser un problema significante, limitando la vida útil de muchas frutas y vegetales, los cuales han tenido un corto tratamiento térmico durante el procesado. Sin embargo, la oxidación enzimática no siempre es innecesaria; pues contribuye a la coloración y aroma deseado de las pasas, ciruelas, café, té y cacao. 

En el caso del té y el cacao el proceso de oxidación es incorrectamente llamado fermentación, pues microorganismos están implicados en las reacciones fermentativas, lo que no ocurre en la oxidación enzimática. 

A pesar de que la oxidación enzimática causa cambios en el aroma y sabor (amargo, astringente), y puede reducir la calidad, las melaninas formadas no son tóxicas. Frutas oscurecidas son seguras de comer después de algunas horas de haber sido cortadas. 

IV.- ANEXOS


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